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ℹ️ 本文由 AI 撰写，已通过 3 个大模型交叉审核（内容准确性 / 结构完整性 / 可读性 / 考点实用性）。不是教材原文，建议对照教材使用。

稀释涂布法 ​

一、定义与目的 ​

稀释涂布法，又称涂布平板法，是微生物学中用于分离和计数微生物的一种基本技术。其核心操作是：将一定浓度、经过一系列梯度稀释的菌液，定量地涂布在固体培养基表面，经过培养后，根据平板上长出的单菌落数目来推算原始样品中的活菌数量。

主要目的：

  1. 分离纯化微生物：获得由单个细胞繁殖形成的、遗传性状一致的菌落。
  2. 活菌计数：统计样品中可培养的活菌数量，单位通常为菌落形成单位每毫升（CFU/mL）。

二、核心原理 ​

该方法的理论基础是“稀释”与“分散”。

  1. 稀释：通过无菌操作，将原始菌液按一定比例（如 1:10）进行连续稀释，使菌液浓度逐渐降低。目的是使最终涂布的菌液中微生物细胞充分分散。
  2. 分散：取少量稀释后的菌液（通常为 0.1mL 或 0.2mL），用无菌涂布棒在平板表面均匀涂开。目的是使细胞在培养基表面固定位置生长，避免移动或聚集。
  3. 单菌落形成：经过适宜条件培养后，分散在培养基上的单个活细胞会生长繁殖，形成一个肉眼可见的、独立的菌落。一个菌落理论上代表原始样品中的一个活细胞。

计数公式： 每毫升样品中的菌落形成单位数（CFU/mL）计算公式为：

CFU/mL=平板上的平均菌落数涂布用的菌液体积（mL）×稀释倍数

例如：你选择了 10−5 稀释度的菌液 0.1mL 进行涂布，培养后平板平均菌落数为 85，则原始样品浓度为：

CFU/mL=850.1×10−5=85×106=8.5×107

三、操作步骤与关键要点 ​

1. 样品稀释 ​

  • 工具：无菌试管、移液器（枪头）、无菌生理盐水或缓冲液。
  • 操作：通常进行 10 倍系列稀释（如 10−1,10−2,10−3...）。每一步稀释都需更换无菌枪头，并充分混匀。

2. 涂布平板 ​

  • 工具：无菌涂布棒（玻璃棒或一次性塑料棒）、已凝固的固体平板。
  • 操作： a. 取 0.1mL 选定稀释度的菌液，滴加至平板中央。 b. 用无菌涂布棒，先将液滴轻轻沿平板表面划开，然后快速、均匀地旋转涂布整个平板表面。 c. 关键：涂布棒需用酒精浸泡并灼烧灭菌，冷却后再使用，以免烫死微生物。

3. 培养与计数 ​

  • 涂布后，将平板正置放置片刻，待菌液被培养基吸收后，再倒置于适宜温度（如 37∘C）的培养箱中培养。
  • 选择菌落数在 30−300 个之间的平板进行计数。此范围统计结果相对准确。过多会重叠，过少则误差大。

四、典型例题与解题思路 ​

例题：为测定某酸奶中的乳酸菌活菌数，进行了稀释涂布实验。依次进行了 10−1 到 10−7 的稀释，并分别取 0.1mL 涂布平板。培养后，10−5 稀释度的平板菌落数分别为 305 和 298；10−6 稀释度的平板菌落数分别为 32 和 28。请计算每克酸奶中的乳酸菌活菌数（CFU/g）。

解题思路：

  1. 选择有效平板：根据“30−300”原则，10−5 稀释度的菌落数 >300，无效；10−6 稀释度的菌落数在范围内，有效。
  2. 计算平均菌落数：(32+28)/2=30
  3. 代入公式计算：CFU/mL=300.1×10−6=30×107=3.0×108若样品为 1g 相当于 1mL，则结果为 3.0×108 CFU/g。
  4. 规范报告：通常用科学计数法表示，并注明所用方法。

五、常见考点提示 ​

  1. 稀释度选择：必须理解为何要选择多个稀释度进行涂布，以及为何要选菌落数 30−300 的平板计数。
  2. 无菌操作：整个过程中防止杂菌污染是成功的关键，所有步骤均需在酒精灯火焰旁进行。
  3. 结果计算：公式应用是高频计算题考点。务必注意“涂布体积”和“稀释倍数”不能遗漏或算错。稀释倍数是 10−n，不是 n。
  4. 方法比较：常与平板划线法对比。划线法主要用于分离纯化，不用于精确计数；稀释涂布法两者皆可，尤其用于定量计数。
  5. 误差分析：
    • 菌落过多连成一片：稀释度不够或涂布不匀。
    • 平板无菌落或菌落极少：可能菌液浓度太低、涂布棒温度过高烫死菌、或样品中无活菌。
    • 平板长满杂菌：操作污染。

记忆口诀：系列稀释要记牢，涂布均匀很重要，三十三百范围好，公式计算别忘掉。

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